圖解中國藥典控制菌檢查法（二）
 

　　方法適用性試驗
 

　　試驗菌：根據(jù)供試品所需檢查的控制菌選擇相應試驗菌株，確認耐膽鹽革蘭陰性菌檢查方法時，采用大腸埃希菌和銅綠假單胞菌為試驗菌。
 

　　依相應的控制菌檢查方法，在規(guī)定的溫度和最短時間下培養(yǎng)，應能檢出相應控制菌。
 

　　若未檢出試驗菌，應消除供試品的抑菌活性[見非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法(通則1105)中的“抗菌活性的去除或滅活”]，并重新進行方法適用性試驗。
 

　　如果經(jīng)過試驗確證供試品對試驗菌的抗菌作用無法消除，可認為受抑制的微生物不易存在于該供試品中，選擇抑菌成分消除相對*的方法進行供試品的檢查。
 

　　
 

　　供試品檢查
 

　　供試品的控制菌檢查應按經(jīng)方法適用性試驗確認的方法進行。
 

　　陽性對照：對照菌的加量應不大于100cfu，應檢出相應的控制菌?！灸湍扄}革蘭陰性菌檢查中的陽性對照株使用大腸埃希菌或銅綠假單胞菌；梭菌檢查中的陽性對照株使用生孢梭菌】
 

　　陰性對照：以稀釋劑代替供試液，應無菌生長。如果有菌生長，應進行偏差調(diào)查。
 

　　
 

　　3.1耐膽鹽革蘭陰性菌（Bile-Tolerant Gram-Negative Bacteria)
 

　　簡述：耐膽鹽革蘭陰性菌是指能夠耐受膽鹽，在紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中生長的革蘭陰性桿菌，一般包括腸桿菌科、假單胞菌屬、氣單胞菌屬等。其作為衛(wèi)生指標，與大腸菌群有類似的指示作用。對于非無菌產(chǎn)品而言，檢出耐膽鹽革蘭陰性菌或超標，指示生產(chǎn)工藝存在缺陷、原輔料受到污染、生產(chǎn)、儲運緩解微生物污染控制措施失效等。
 

　　在紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中生長的革蘭陰性桿菌
 

　　根據(jù)標準規(guī)定選擇定性或定量方法。若標準規(guī)定為“不得檢出耐膽鹽革蘭陰性菌”，則選擇“定性試驗”檢驗；若標準規(guī)定為“耐膽鹽革蘭陰性菌應<10n cfu/g(ml)”，則選擇“定量試驗”檢驗。
 

　　試驗步驟如下圖：
 

　　通過選擇性增菌，紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中生長的菌應為革蘭陰性菌，但仍需進行革蘭染色進行確認。
 

　　陽性對照試驗使用大腸埃希菌或銅綠假單胞菌，并在接種EE的步驟加入對照菌。
 

　　培養(yǎng)基：
 

　　3.2大腸埃希菌（Escherichia coli）
 

　　簡述：大腸埃希菌為腸桿菌科埃希菌屬的模式種。大腸埃希菌是人和溫血動物腸道內(nèi)的棲居菌，隨糞便排出體外。在藥品中檢出大腸埃希菌，表明該樣品受到人和溫血動物的糞便污染，即可能污染腸道病原體。除普通大腸埃希菌外，尚有致病性大腸埃希菌，可引起嬰幼兒、成人爆發(fā)性腹瀉。為保證人體健康，口服藥品必須檢查大腸埃希菌。
 

　　試驗步驟如下圖：

 

　　大腸埃希菌檢查應鑒定到“種”水平。
 

　　麥康凱液體的培養(yǎng)溫度為42~44℃，因為該條件是區(qū)分大腸埃希菌和大腸菌群其他“種”的關鍵條件，另外有文獻報道表明：受到人和溫血動物糞便污染的大腸埃希菌在42~44℃更容易生長。
 

　　大腸埃希菌在麥康凱瓊脂中的典型菌落形態(tài)特征：鮮桃紅色或微紅色，菌落中心呈深桃紅色，圓形，扁平，邊緣整齊，表面光滑，濕潤。
 

大腸埃希菌在麥康凱瓊脂上
 

　　結果與判定：MUG和靛基質試驗可以作為確認的參考方法。IMViC試驗亦可以作為鑒定和確認的參考。
 

　　培養(yǎng)基：
 

 

　　3.3沙門菌（Salmonella）
 

　　簡述：沙門菌屬是腸桿菌科的重要致病菌。在沙門菌的分類學研究和流行病學研究中，按照血清型進行分類更為常見，一般來說，O抗原抗血清的A-E群包含了沙門菌分離株的95%，所以可以用沙門菌A-F O多價血清進行沙門菌初篩試驗。
 

　　試驗步驟如下圖：

 

藥品中的沙門菌，是以鑒定沙門菌屬為準。
 

　　與其他控制菌相比，沙門菌檢查的取樣量較大(10g或10mL的供試品)，經(jīng)方法適用性試驗，可適當增加TSB的體積，消除可能的抑菌作用。
 

　　使用RV培養(yǎng)基應控制預增菌液的加入量，一般要求1:100 ~1:2000之間。
 

　　沙門菌在XLD中典型菌落為淡紅色或無色、透明或半透明、中心有或無黑色。使用XLD時需注意：①培養(yǎng)超過48h可能造成某些微生物的假陽性；②某些變形桿菌菌株可能會出現(xiàn)黑心菌落；③甲型副傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、雞白痢沙門氏菌及雞傷寒沙門氏菌可能會形成無黑心紅色菌落，與志賀氏菌混淆。
 

　　在TSI高層斜面試驗中，建議同時接種沙門菌、大腸埃希菌或其他類似腸桿菌科的標準菌株作為對照菌，輔助判斷斜面和底層的顏色反應。
 

　　沙門菌利用培養(yǎng)基中的葡萄糖產(chǎn)酸使斜面先變黃，生成的少量酸接觸空氣氧化，同時利用培養(yǎng)基中含氮物質，生成堿性產(chǎn)物，使斜面變紅。底層在缺氧狀態(tài)下，細菌分解葡萄糖生成的酸類一時不被氧化而仍保持黃色。
 

　　培養(yǎng)基：
 

　　3.4銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）
 

　　簡述：銅綠假單胞菌為假單胞菌屬菌種，本菌是常見的化膿性感染菌，在燒傷、燙傷、眼科及其他外科疾患中常引起繼發(fā)感染，優(yōu)于本菌對許多抗菌藥物具有天然的耐藥性，增加了治療的難度，國內(nèi)外藥典均將銅綠假單胞菌檢查被列為外用制劑的檢查項目之一。
 

　　試驗步驟如下圖：
 

 

　　銅綠假單胞菌檢查應鑒定到“種”水平。
 

　　溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基(以下簡稱“CA”)上若有菌生長，均需要鏡檢鑒定。典型的銅綠假單胞菌在CA上形成藍綠色菌落，在254nm的紫外燈下顯熒光；有個別株不產(chǎn)綠膿菌素，但在254nm的紫外燈下仍顯熒光。
 

　　銅綠假單胞菌在CA上

 

　　若需要進一步進行適宜的鑒定試驗，可以進行綠膿菌素試驗、硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗、42℃生長試驗和明膠液化試驗，判定如下圖。
 

 

培養(yǎng)基： 

 

　　3.5金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
 

　　簡述：金黃色葡萄球菌為葡萄球菌屬中的一種。本菌可產(chǎn)生多種毒素及酶，這些毒性物質能引起局部及全身化膿性炎癥，嚴重時可發(fā)展成為敗血癥和膿毒血癥，是人類化膿性感染中重要的病原菌。金黃色葡萄球菌檢查是外用制劑的檢查項目之一。
 

　　試驗步驟如下圖：
 

 

　　金黃色葡萄球菌檢查應鑒定到“種”水平。
 

　　典型的金黃色葡萄球菌在MSA上呈黃色菌落或外周有黃色環(huán)的白色菌落，而表皮葡萄球菌則能使培養(yǎng)基呈紅色。菌落呈黃色表示該菌很可能血漿凝固酶呈陽性，而菌落呈紅色則表示血漿凝固酶呈陰性。
 

　　除MSA外，還可以將疑似菌落劃線至Baird-Parker平板和血平板上。金黃色葡萄球菌在Baird-Parker平板上呈圓形，表面光滑、凸起、濕潤、菌落直徑為2~3mm，顏色呈灰黑色至黑色，有光澤，常有淺色(非白色)的邊緣，周圍繞以不透明圈(沉淀)，其外常有一清晰帶。在血平板上，形成菌落較大，圓形、光滑凸起、濕潤、金黃色(有時為白色)，菌落周圍可見*透明溶血圈。
 

　　確證的關鍵試驗為血漿凝固酶試驗，注意需同時進行陽性對照(金黃色葡萄球菌菌懸液)和陰性對照試驗(空白培養(yǎng)液或稀釋液)。
 

　　選擇性平板上為典型菌落，革蘭陽性球菌，血漿凝固酶試驗陽性，則判檢出金黃色葡萄球菌。

 

金黃色葡萄球菌在甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基上
 

　　培養(yǎng)基：
 

　　3.6梭菌（Clostridia）
 

　　簡述：梭菌屬主要病原菌有：產(chǎn)氣莢膜梭菌、破傷風梭菌、肉毒梭菌和艱難梭菌等，均能產(chǎn)生強烈的外毒素使人和動物治病。因此對于某些用于陰道、創(chuàng)傷、潰瘍的藥品，必須控制梭菌。
 

　　試驗步驟如下圖：

 

　　梭菌檢查需鑒別到“屬”水平。
 

　　梭菌屬細菌芽孢體對外界的抵抗力強，耐高溫耐干燥，對新霉素、卡拉霉素、慶大霉素等抗生素不敏感。因此將供試液在80℃保溫10分鐘后迅速冷卻，以殺死可能存在的雜菌繁殖體，使梭菌具有優(yōu)勢生長；或在哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基中加入慶大霉素，抑制雜菌，利于梭菌的分離培養(yǎng)。
 

　　梭菌革蘭染色鏡檢的典型形態(tài)特征為：培養(yǎng)后形成的芽孢，初呈“火柴頭”狀卵圓形，繼而膨大呈球形，在菌體末端如鼓槌狀。培養(yǎng)72小時以上時，菌體可自溶而消失，僅見游離的芽孢囊，一般染色時呈圓圈狀。染色鏡檢有卵圓形至球形的芽孢，大于菌體，著生于菌體中央、次端或頂端，為梭菌典型形態(tài)。
 

　　鑒別梭菌的關鍵生化反應為過氧化氫酶試驗，梭菌應呈陰性(無氣泡形成)，可用枯草芽孢桿菌作為陽性對照(有氣泡形成)。
 

　　培養(yǎng)基：

 

　　簡述：白色念珠菌又名白假絲酵母菌，屬假絲酵母菌屬。白色念珠菌是條件致病菌，是醫(yī)學全身性真菌感染病的重要組成之一，一旦感染，?？梢鹦膬?nèi)膜炎、肺炎、尿布疹、鵝口瘡、陰道炎、腦膜炎及敗血癥等。白色念珠菌廣泛分布于土壤、水和空氣中，目前國內(nèi)外藥品、食品標準已把白色念珠菌作為微生物檢驗中酵母菌的代表均，因此有些藥品依據(jù)給藥途徑和劑型將白色念珠菌作為控制菌是非常必要的。
 

　　試驗步驟如下圖：
 

　　白色念珠菌檢查應鑒定到“種”水平。
 

　　白色念珠菌在SDA中呈乳白色，偶見淡黃色，表面光滑，有濃酵母氣味，培養(yǎng)時間稍久則菌落增大，顏色變深、質地變硬或有褶皺。
 

         培養(yǎng)基：

 

 

　　a.如果陽性對照試驗中陽性菌未生長，則表明檢驗方法或檢驗過程存在干擾因素，應判斷無效，并進行偏差調(diào)查，調(diào)查的因素包括培養(yǎng)基的配制、滅菌、培養(yǎng)基的適用性檢查、試驗器具的滅菌、檢驗的潔凈環(huán)境、人員操作、方法適用性試驗等。
 

　　b.如果陰性對照試驗有菌生長，表明試驗過程存在污染可能，試驗結果無效，應進行偏差調(diào)查，調(diào)查的因素包括培養(yǎng)基的配制、滅菌、試驗器具的滅菌、檢驗的潔凈環(huán)境、人員操作等。
 

　　c.在檢驗過程中，發(fā)現(xiàn)有控制菌或不可接受微生物的檢出，則認為是超標或異常檢驗結果，應立即啟動OOS調(diào)查。對于藥品檢驗機構而言，OOS調(diào)查即實驗室調(diào)查，包括影響檢驗結果的所有因素，如試驗人員、試驗方法、取樣程序、實驗設備、試驗器具、培養(yǎng)基、試驗環(huán)境等，隨著調(diào)查結果和流程，可以延伸到其他部門。對于生產(chǎn)企業(yè)而言，OOS調(diào)查包括實驗室調(diào)查和生產(chǎn)環(huán)節(jié)調(diào)查。實驗室調(diào)查包括上述內(nèi)容，如果實驗室調(diào)查認為實驗結果有效，則應擴大調(diào)查至生產(chǎn)環(huán)節(jié)。一般來說，生產(chǎn)環(huán)節(jié)的調(diào)查包括檢出菌特性分析(包括來源、危害、耐受性、是否會產(chǎn)生生物膜等)、檢出菌的數(shù)量評估、檢出菌在物料或終產(chǎn)品中的生長特性分析、生產(chǎn)的某些工藝是否對檢出菌有抑制或殺滅作用、實驗檢出相同菌的歷史調(diào)查、生產(chǎn)過程的詳細分析(包括原輔料、水系統(tǒng)以及包裝材料的檢驗、物料的轉運、生產(chǎn)工藝參數(shù)、包裝)等；通過生產(chǎn)調(diào)查，根據(jù)調(diào)查結果進行風險評估判斷該產(chǎn)品是否放行，并查找根本原因，制訂糾正和預防措施。
 

　　參考：
 

　　[1] 《中國藥典》2020年版四部 1106 非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法；
 

　　[2] 《中國藥典》2020年版四部 9204微生物鑒定指導原則；
 

　　[3] 《中國藥品檢驗標準操作規(guī)范》2019年版。